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人腫瘤壞死因子α elisa試劑盒說明書(二)

人腫瘤壞死因子α  ELISA試劑盒說明書(二)

人腫瘤壞死因子α  ELISA試劑盒說明書(二)

上海原鑫生物科技從事科研試劑的優質企業。該文章詳細的介紹了人腫瘤壞死因子α  ELISA試劑盒的樣本收集及儲存、試劑準備、檢測步驟、結果判斷、參數表征和常見問題及解決方法這六個方面。本文僅供于科研研究,不得用于臨床試驗!


、樣本收集及儲存

1. 細胞培養上清: 將細胞培養基移至無菌離心管,在 4℃條件下1000 ×g 離心10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存(24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存),避免反復凍融。

2. 血清樣本: 室溫血液自然凝固 20 min 后,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存(24 小時內檢測可放入2-8℃儲存),保存過程中如有沉淀,請再次離心,避免反復凍融。

3. 血漿樣本: 將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據標本的實際要求選擇 EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混 合 20 min,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存),避免反復凍融。

注意事項:血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,以免影響檢測結果;如果樣本中的靶標物檢測濃度高 于標準品的最高值,請將樣品做適當倍數稀釋后檢測,建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。


二、試劑準備

1. 試劑回溫:首先在實驗前 30 min 將試劑盒,待測樣本放置于室溫下復溫。

2. 配制洗滌液:預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,然后用超純水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應用液,未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋:在標準品中加入1ml標準品稀釋液至完全溶解,按照濃度為2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156.25pg/ml、78.13pg/ml、39.06pg/ml進行等比稀釋,具體操作如下圖所示。


三、檢測步驟

1.  按照實驗設計,在標準品與樣本孔中加樣100ul,空白對照不加    

2.  25℃避光孵育2h      

3.  棄去液體,用洗滌液清洗4次,每次每孔至少加洗滌液300ul,洗完后吸水紙上拍干

4.  加入酶標抗體溶液100ul,空白對照不加,25℃避光孵育1h    

5.  同步驟3      

6.  每孔加入底物A、B各50ul,25℃避光孵育20min,顯色淺可適當延長孵育時間

7.  加入終止液50ul,10min內在450nm波長處測OD值


四、結果判斷

1.   用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。

2.   計算標準品、樣品的平均 OD 值:每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值

3.   以標準品濃度為橫坐標,吸光度OD值為縱坐標,用軟件繪制標準曲線,樣品中TNFA含量可通過對應OD 值由標準曲線換算出相應的濃度。

 若標本 OD 值高于標準曲線上限,應做適當稀釋后重新檢測,計算濃度時再乘以稀釋倍數


五、參數表征

1.數據及標準曲線


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2.  準確度:標準品線性回歸與預期濃度相關系數R>0.95      

3.  檢測范圍:39.06-2500pg/ml(如超出檢測范圍,需將樣本稀釋后檢測)  

4.  靈敏度:≤39.06pg/ml      

4 特異性:不與其他可溶性結構類似物交叉反應      

5 重復性:變異系數≤15%      

6 儲存條件:2-8℃冷藏      

7 有效期:6個月


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